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| 品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,制藥/生物制藥 |
間充質干細胞無血清培養基
MSC BeautiStemTM XF Medium
一、目的：利用間充質干細胞無血清培養基培養分離臍帶間充質干細胞。二、材料：新生兒臍帶
三、主要儀器：醫用手術器械，生物安全柜，CO2 培養箱，6 孔培養板，T25 培養瓶
四、試劑：
表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium
品牌 | 貨號 | 名稱 | 規格 | 保存條件 |
NANOLAB | NA500 | MSC BeautiStemTM XF Basal Medium MSC 無血清基礎培養基 | 500ml | 4℃ |
NANOLAB | NAS03 | MSC BeautiStemTM XF Supplement MSC 無血清添加劑 | 3ml | -20℃ |
NANOLAB | NAA01 | MSC Attachment solution (100X) MSC 貼壁試劑 | 1 ml | 4℃ |
NANOLAB | P0500LT | Human Platelet Lysate 血小板裂解物 | 500ml | -20℃ |
表 2 建議選用試劑
NANOLAB | NA079-100ML | Recombinant Trypsin-EDTA Solution 重組胰酶-EDTA | 100ml | RT |
NANOLAB | NA048-20ML | Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制劑 | 20 ml | -20℃ |
NANOLAB | NA712-10ML | MSC Freezing Solution MSC 凍存液 | 10 ml | 4℃ |
NANOLAB | NA023-500ML | DPBS (w/o Ca & Mg) DPBS 緩沖液 | 500 ml | RT |
NANOLAB | NA031-100ML | Penicillin-Streptomycin Solution(100X)青鏈雙抗 | 100ml | -20℃ |
NANOLAB | NA35010100 | MSC ACF Tissue Digestive Mix ACF 高效原代間充質干細胞分離液 | 100ml | -20℃ |
五，實驗前準備：
5.1 *培養基的準備
5.1.1 凍存的 MSC BeautiStemTM XF Supplement 在室溫或 2-8℃解凍，避免反復凍融。
5.1.2 配制：MSC BeautiStemTM XF Basal Medium（培養基）：MSC BeautiStemTM XF
Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2 周內使用。
注 1：雙抗非必須，建議原代（P0）時使用。
注 2：培養基含 L-Glutamine，貯藏時避免長期照光。
5.2 包被培養皿
或跳過此步驟，直接加 2%血小板裂解物（P0500LT），促進 MSC 細胞貼壁與生長。
5.2.1 使用 DPBS 溶液（貨號：NA023-500ML），將 MSC 貼壁試劑稀釋 100 倍（1:100）。
5.2.2 參照表 3，加入適量的 1XMSC 貼壁試劑涂層培養皿或板。
表 3 涂層過程中貼壁試劑建議使用量
培養器皿 | 表面積 cm2/孔或瓶 | 1X MSC 貼壁試劑使用體積 |
96 孔板 | 0.34 | 0.05~0.1 ml |
24 孔板 | 1.9 | 0.2~0.4 ml |
12 孔板 | 3.9 | 0.4~0.8 ml |
6 孔板/ 35 cm 培養皿 | 9.6 | 1~2 ml |
T25 瓶/ 60 cm 培養皿 | 25 | 2.5~5 ml |
T75 瓶 | 75 | 7.5~15 ml |
注 1：涂層的培養皿需在無菌條件下 2℃-8℃儲存，需在一周內使用。（標示紅色為原廠建議使用量，經過實驗測試后可減半使用）
注 2：包被期間， 注意包被液不可以干掉！
注 3：若使用預包被培養瓶（Corning 的 CellBind，貨號：3289/3290 等）, 步驟 5.2 的包被可略過。
5.2.3 輕輕搖動培養皿，確認貼壁試劑均勻分布在培養皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養皿。
5.2.4 在 2-8℃孵育過夜；或者在 CO2 培養箱，37℃，至少孵育 30 分鐘。
5.2.5 接種前, 吸除貼壁試劑，再用 DPBS 輕輕沖洗培養皿，即可接種細胞。
5.3 制備 1X 大豆胰酶抑制劑
5.3.1 使用無菌的 DPBS，將 50X 大豆胰酶抑制劑（NA048-20ML）稀釋成 1X。
六、使用范例：
6.1 UC-MSC 原代培養 （組織塊法）
6.1.1 無菌條件下取新鮮臍帶，用 DPBS 漂洗凈血跡
* 一般臍帶取得非無菌環境，可以稍微用 75%酒精潤洗。
6.1.2 置 10cm 培養皿中，剪成 1~2cm 臍段，剔除血管，用 DPBS 洗凈血跡，再剪成 1mm3
組織塊。(圖 1)
6.1.3 用無菌滴管吸取少量細小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中。
6.1.4 37℃，5%CO2 培養箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養皿壁上。
6.1.5 向每孔滴加 0.8ml *培養基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動組織塊)。
6.1.6 37℃，5% CO2 培養箱孵育過夜，次日 (D1) 每孔再補加 1ml *培養基。
6.1.7 37℃，5% CO2 繼續培養，5 天 (D6) 后半量換液 (此時一般看不到細胞，但快 3
天就可看到細胞從組織邊沿爬出)。
6.1.8 再過 5 天后半量換液 (此時一般會有細胞爬出，但晚可到 14 天會出現細胞從組織邊沿爬出) (圖 2、圖 3)。
6.1.9 每 2 天換一次培養液，繼續培養 2~4 天，待細胞融合度（Confluency）達到約 80%
后傳代培養(圖 4)。
注 1：組織塊培養的關鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動作要盡可能輕微，避免沖動組織塊。培養基加量不能太多，以免組織塊漂浮。
注 2：為增加成功率，從原代分離臍帶和脂肪間充質干細胞, 培養基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必須除菌過濾，且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗體陰性)。
6.2 UC-MSC 原代培養 （消化法）
MSC BeautiStemTM XF Medium 也能有效地培養消化法取得的原代細胞，操做方式可依各實驗室的實驗步驟，或參考上海中韜 MSC ACF Tissue Digestive Mix (貨號：C35010010) 的使用說明。
6.2.1 將臍帶用 DPBS 漂洗干凈，剪成 1-2cm,后剔除血管。
* 一般臍帶取得非無菌環境，可以稍微用 75%酒精潤洗。
6.2.2 將組織剪成 3-5mm3 后，移入 50ml 離心管，再加入的分離液。
* 一條長度 10 公分的臍帶建議加入 10ml 的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1。
** 視情況而定，可自行在分離液中添加 1%青鏈雙抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。
6.2.3 把 50ml 離心管橫放在 37 度細胞培養箱，過夜反應（16 小時）。
* 若總反應體積較大，也可持續旋轉混合。
6.2.4 加入和分離液等體積的 0.05%EDTA（NANOLAB, Cat#NA015-100ML）終止反應后，1500 xg 離心5 分鐘，去除上清。
* 溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細胞;建議留下 5ml 左右的溶液。
** 若是脂肪組織，沒有粘稠的情形，以常規的 200-300 xg 離心即可。
*** 沒有 EDTA, 可使用無鈣鎂 DPBS 取代；此時建議后面步驟 6 多重復 2-3 次，以確實去除酵素。
6.2.5 以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細胞后，500 xg 離心 5 分鐘，去除上清。
6.2.6 再次以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細胞后，250 xg 離心 5 分鐘，去除上清。
6.2.7 用適量的培養基重懸細胞后，即可按常規細胞培養方法接種 P0 代細胞培養。
* 消化后的原代細胞，建議培養時接種密度提高到 10,000/cm2 以上；傳代后即可按常規的接種密度培養。
6.3 UC-MSC 傳代培養與凍存
6.3.1 待細胞融和度達到約 80%后進行傳代（細胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養基，每孔加適量 DPBS 輕輕沖洗 1 次。
6.3.2 根據培養皿適量加入重組胰酶-EDTA（貨號：NA079-100ML，T25 建議使用 1ml），在 37℃，5% CO2 培養箱作用 3~5 min（可輕拍培養瓶幫助細胞脫落）。
6.3.3 顯微鏡下觀察細胞*脫落后, 根據重組胰酶-EDTA 使用量加入10 倍體積的大豆胰
酶抑制劑（1X），1000rpm 離心 3~5min。例：用 1ml 重組胰酶-EDTA，則加入 1ml
大豆胰酶抑制劑（1X）與細胞混和均勻，再離心。
6.3.4謹慎吸出上清，細胞團塊用適當體積的*培養基懸浮后，混勻細胞懸液。
6.3.5 按照所需的比例進行傳代或按照 5000-6000cells/cm2 的細胞密度將細胞接種至培養器皿中，放入 37℃, 5% CO2 培養箱內培養。
6.3.6每 2-3 天更換一次培養基， 待細胞融合度達到 80% 左右時，參照操作步驟
6.3.1~6.3.5 做細胞傳代;或者參照操作步驟 6.3.1~6.3.3 收獲細胞凍存。
6.3.7 細胞凍存：將細胞團塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 凍存液（貨號： NA712-10ML）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置 30min，-80℃冰箱放置 24h，轉入液氮罐凍存。
注：本方法僅供參考，用戶可根據自身經驗做合理調整。附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）
